18 de agosto de 2022

MECANISMOS DE ESTRÉS DE LAS CÉLULAS-Β EN LA DIABETES MELLITUS TIPO 1: POTENCIAL TERAPÉUTICO DE UN MODULADOR SELECTIVO DEL RECEPTOR DE GLUCOCORTICOIDES.

Dra. LUZ ANDREONE, Investigadora Adjunta CONICET. Laboratorio de Inmuno-Endocrinología, Diabetes y Metabolismo, Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional, IIMT, CONICET-Univ. Austral.

Información de la línea de investigación: https://www.austral.edu.ar/cienciasbiomedicas/investigacion/instituto-de-investigaciones-en-medicina-traslacional-iimt/investigacion-instituto-de-investigaciones-en-medicina-traslacional-iimt-inmuno-endocrinologia-diabetes-y-metabolismo/

Resumen del seminario
Las células-β, especializadas para producir y secretar insulina regulando los niveles de glucosa en sangre, son muy vulnerables a diferentes tipos de estrés celular. Durante la patogénesis de la diabetes tipo 1, las citoquinas pro-inflamatorias en el microambiente del islote conducen a la activación de estrés de retículo endoplásmico, estrés oxidativo y a la disfunción y muerte de las células-β. Proteger estas células en el contexto de la diabetes es un objetivo clínico de suma importancia. En el laboratorio estudiamos los efectos protectores de un modulador selectivo del receptor de glucocorticoides sobre el estrés inducido por citoquinas pro-inflamatorias en las células-β y evaluamos su posible acción terapéutica en un modelo de diabetes autoinmune.

Resultados discutidos
El compuesto A (CpdA) es un ligando no esteroideo del receptor a glucocorticoides (GR) con propiedades disociativas. El mismo, que deriva de un arbusto africano llamado Salsola tuberculatiformis botschenzev, mantiene los efectos antiinflamatorios asociados a los mecanismos de trans-represión de los GC, mientras que no induce la dimerización del GR asociada a los mecanismos de trans-activación vinculados a los efectos no deseados. Su aislamiento y primera descripción fueron realizados por la Dra. De Bosscher en un laboratorio en Bélgica.
Los primeros estudios en distintos modelos animales de enfermedades inflamatorias mostraron un efecto antiinflamatorio con efectos adversos reducidos.

En el Laboratorio de Inmuno-Endocrinología, Diabetes y Metabolismo (IIMT, CONICET-Univ. Austral) se comenzó estudiando los efectos de CpdA sobre el sistema inmune.
-Se observó que CpdA era capaz de regular la respuesta inflamatoria en Linfocitos T (LT). Éste disminuyó la expresión de citoquinas pro-inflamatorias como INFγ, IL6 y TNFα, además de reducir la respuesta de tipo Th1, asociada a la fisiopatología de la Diabetes tipo I.
-Posteriormente, este mismo compuesto se probó en células dendríticas, observándose la modulación de la respuesta de las mismas, mediante una disminución de la secreción de citoquinas pro-inflamatorias (IL-12p70, IL6 y TNFα), una reducción en la activación de vías de señalización asociadas a la activación de receptores Toll (en particular el TLR4, que responde al estímulo con LPS) y una disminución de marcadores de maduración/activación de las células dendríticas, inhibiéndose en consecuencia su capacidad para activar LT.

En base a esto, en el marco del estudio de la fisiopatogenia de la Diabetes tipo I, surgió el interés de indagar en la posible acción de este compuesto no solo sobre la modulación del sistema inmune, sino también sobre la célula β misma.
Los mecanismos que están involucrados en el censado de los niveles de glucosa por las células β hacen que las mismas sean muy sensibles a distintos tipos de estrés. Este mecanismo genera gran cantidad de radicales libres y las enzimas antioxidantes son de muy baja expresión habitualmente en dichas células. Dentro de los tipos de estrés asociados al desarrollo de la Diabetes están el estrés oxidativo y el estrés del retículo endoplásmico (RE). Este último puede evidenciarse antes de que se observen los signos clínicos de la enfermedad. El mismo se desarrolla cuando dentro del RE existen proteínas mal plegadas y es gatillado por distintos eventos que pueden ser internos y externos como la hipoxia, alta concentración de AGL, aumento de EROs, etc. En particular para el caso de la Diabetes los eventos pueden ser: mutaciones en el gen de la insulina, hiperglucemia (que provoca estrés oxidativo), citoquinas pro-inflamatorias, entre otros. El estrés del RE desencadena distintas vías que en un principio están orientadas a recuperar la homeostasis de la célula, pero cuando se hace crónico puede derivar en la apoptosis.

Modelos de estudio in vitro: línea celular de insulinoma de rata, islotes pancreáticos aislados de ratones y algunas muestras de islotes humanos.

Línea celular de insulinoma de rata:

-Se sabe que la IL-1 actúa mediante la activación de NFκB, aumentando los niveles de NO. Se evaluó el efecto de CpdA a este nivel observándose que éste era capaz de reducir la producción de NO en células β inducido por citoquinas pro-inflamatorias, mediante la disminución de la expresión de la iNOS (ARNm y proteína).
-Además, se vio que CpdA disminuye la fosforilación de IκBα, que se une y secuestra a NFκB en el citoplasma cuando no está fosforilado y es enviado a degradación proteasómica cuando lo está. De esta forma, CpdA bloquea la activación de esta vía, lo cual pudo evidenciarse también mediante ensayos de inmunofluorescencia en los cuales se vio una disminución de la translocación inducida por citoquinas de NFκB al núcleo (algo que no se observó con el tratamiento con Dexametasona).
-Al evaluar la vía eIF2α/ATF4/CHOP, asociada a estrés del RE y que es inducida por la citoquinas pro-inflamatorias, se observó que CpdA fue capaz de inhibir a todos sus actores.
-Al estudiar otras vías asociadas a estrés del RE, más relacionadas a respuestas de sobrevida, UPR (respuesta a proteínas mal plegadas), se vio mediante ensayos de gen reportero que CpdA estimula la actividad transcripcional de los factores de transcripción XBP1 y ATF6 (este último asociado a la expresión de chaperonas del RE), además de favorecer la expresión de las chaperonas BIP, PDI y ORP 150.
-Dado que otro grupo de investigación observó que varios de los efectos de CpdA en macrófagos no se producían a través del GR, se utilizó CpdA en conjunto con un antagonista del GR en células β, no observándose diferencias en cuanto al efecto de CpdA y si respecto al efecto de dexametasona.
Cuando comienzan a fallar las células β, comienzan a aumentar los niveles de glucosa en sangre y, este aumento de la glucemia va a generar un estrés oxidativo extra en la célula β, produciéndose un círculo vicioso.
-Se evaluó el efecto de CpdA sobre un factor de transcripción clave (NRF2) que se activa como respuesta antioxidante, observándose que éste compuesto aumenta su actividad transcripcional tanto en presencia como en ausencia de citoquinas. Además, de vio que esto deriva en el aumento de al menos tres de las enzimas target de este FT y en una disminución en la generación de EROs estimulada por citoquinas pro-inflamatorias.
-Asimismo, se evaluó si todo esto tenía algún efecto en la sobrevida de las células β mediante la medición de la expresión del ARNm de Bax (pro apoptótica) y Bcl-2 (anti apoptótica) y la realización del cálculo del índice apoptótico (Bax/Bcl-2). Se evidenció que CpdA fue capaz de contrarrestar el aumento del índice apoptótico producido por el estímulo con citoquinas pro-inflamatorias. Resultados similares se obtuvieron para DP5, un efector apoptótico importante en la célula β.
-Al realizar ensayos de MTT se observó que CpdA mejoró la viabilidad celular, disminuida por la citoquinas pro-inflamatorias.
-Por último se evaluó el efecto de CpdA sobre la funcionalidad de las células, midiendo la producción de insulina por las mismas en respuesta a distintas concentraciones de glucosa (GSIS) en presencia de citoquinas pro-inflamatorias. CpdA mejoró su funcionalidad.

Cultivos primarios de islotes pancreáticos de ratón:
-Se evaluó la apoptosis observándose que CpdA disminuyó la muerte celular inducida por citoquinas pro-inflamatorias.
-En el ensayo de funcionalidad (GSIS) CpdA contrarrestó la disminución en la secreción de insulina producida por el tratamiento con citoquinas pro-inflamatorias.

Muestras de islotes pancreáticos humanos:
-CpdA también contrarrestó la disminución en la secreción de insulina producida por el tratamiento con citoquinas pro-inflamatorias.

Modelos de estudio in vivo: transferencia adoptiva de esplenocitos diabetogénicos tomados del bazo de ratones NOD diabéticos y que son inyectados en ratones NOD scid (diabetes sincronizada y acelerada).
Se realizó el tratamiento con CpdA intraperitoneal 3 veces por semana y se evaluó a diferentes tiempos la glucemia, además de indicadores de posibles efectos adversos.
-No hubo variaciones en el peso corporal.
-Test de sensibilidad a la insulina al día 40 de tratamiento: no hubieron cambios en la capacidad de los tejidos periféricos de responder a una inyección de insulina.
-El tratamiento con CpdA retrasó el inicio de la enfermedad: para el caso de los ratones no tratados, al día 20 comienzan a aumentar los niveles de glucosa en sangre, y al día 40 el 100% de los ratones eran diabéticos; en tanto que para ese mismo tiempo, solo el 50% de los ratones tratados con CpdA habían desarrollado diabetes. Un grupo de ellos (3 ratones), aún al día 100 continuaba normoglucémico.
-A distintos momentos del experimento se fueron tomando ratones para evaluar la insulitis (infiltración linfocitaria de los islotes pancreáticos) observándose una disminución de la infiltración en ratones tratados con CpdA con respecto a los ratones control para el mismo día de tratamiento. Los ratones que continuaron normoglucémicos al día 100 de tratamiento tenían muy pocos islotes con un grado muy bajo de infiltración.
-Al analizarse la expresión de insulina en esos islotes se observó que el tratamiento con CpdA mantuvo dicha expresión.
-Por último, se les realizó un test de tolerancia a la glucosa (vía ip) a los 3 ratones que permanecieron normoglucémicos al día 100. En los ratones no diabéticos se observó aumento de la glucemia seguida de una disminución progresiva, retornando a la normalidad a las 2 hs, en tanto que para los ratones tratados con CpdA que permanecieron normoglucémicos al día 100, si bien la respuesta no fue igual a la de los ratones control ya que habían mayores aumentos de la glucemia luego de la inyección de glucosa, lograban regresar a los valores iniciales a las 2 hs. Para el caso de los ratones diabéticos tratados con vehículo, los niveles de glucemia iniciales eran mucho más elevados y no retornaban a niveles normales a las 2 hs.

Relevancia Patológica
El compuesto A (CpdA) constituye una pequeña molécula derivada del arbusto africano Salsola tuberculatiformis botschenzev que podría tener potencial terapéutico en la Diabetes de tipo I, para la cual hoy en día solo se utiliza la administración de insulina por vía subcutánea con el fin de normalizar la glucemia. Este tratamiento, además de no prevenir el avance de la enfermedad, implica que el paciente deba depender de las inyecciones de insulina varias veces por día, disminuyendo su calidad de vida. CpdA ejercería su efecto terapéutico de manera dual: por un lado, retrasando el inicio de la enfermedad mediante la modulación del sistema inmune, disminuyendo la activación de células dentríticas y linfocitos T que cumplen un rol crucial en la fisiopatogenia de la enfermedad, atenuando la destrucción de las células β secretoras de insulina de los islotes pancreáticos; y por otro lado, reduciendo el daño de la célula β mediante la disminución del estrés oxidativo y del retículo endoplásmico, previniendo su apoptosis y el deterioro en su funcionalidad.

Papers relevantes:

-Backe MB, Jin C, Andreone L, Sankar A, Agger K, Helin K, Madsen AN, Poulsen SS, Bysani M, Bacos K, Ling C, Perone MJ, Holst B, Mandrup-Poulsen T. The Lysine Demethylase KDM5B Regulates Islet Function and Glucose Homeostasis. J Diabetes Res. 2019 Jul 28;2019:5451038.

-Ghiasi SM, Dahlby T, Andersen CH, Haataja L, Petersen S, Omar-Hmeadi M, Yang M, Pihl C, Bresson SE, Khilji MS, Klindt K, Cheta O, Perone MJ, Tyrberg B, Prats C, Barg S, Tengholm A, Arvan P, Mandrup-Poulsen T, Marzec MT. The endoplasmic reticulum chaperone glucose-regulated protein 94 is essential for proinsulin handling. Diabetes (2019) 68(4):747-760.

-Atorrasagasti C, Onorato A, Gimeno ML, Andreone L, Garcia M, Malvicini M, Fiore E, Bayo J, Perone MJ, Mazzolini GD. SPARC is required for the maintenance of glucose homeostasis and insulin secretion in mice. Clinical Science (2019) 133(2):351-365.

-Andreone L, Gimeno ML, and Perone MJ. Interactions between the neuroendocrine system and T lymphocytes in diabetes. Front. Endocrinol (Lausanne) 2018 May 17;9:229.

-Barcala Tabarrozzi AE, Andreone L, Deckers J, Castro CN, Gimeno ML, Ariolfo L, Berguer PM, Antunica Noguerol M, Liberman AC, Vettorazzi S, Tuckermann JP, De Bosscher K, Perone MJ. GR-independent down-modulation on GM-CSF bone marrow-derived dendritic cells by the selective glucocorticoid receptor modulator Compound A. Sci. Rep. 6, 36646; (2016).

-Liberman AC, Antunica-Noguerol M, Ferraz-de-Paula V, Palermo-Neto J, Castro CN, Druker J, Holsboer F, Perone MJ, Gerlo S, De Bosscher K, Haegeman G, Arzt E. Compound A, a dissociated glucocorticoid receptor modulator, inhibits T-bet (Th1) and induces GATA-3 (Th2) activity in immune cells. PLoS One. 2012;7(4):e35155. doi: 10.1371/journal.pone.0035155. Epub 2012 Apr 9. Erratum in: PLoS One. 2012;7(5): doi/10.1371/annotation/12a8fc89-5f47-4bad-8863-863d99a0e52d. PMID: 22496903; PMCID: PMC3322149.