26 de mayo del 2022

LA IMPLICANCIA DEL SISTEMA CIRCADIANO EN LA REGULACIÓN DEL METABOLISMO DE CÉLULAS TUMORALES Y EL CRECIMIENTO TUMORAL

Dr. MARIO E. GUIDO. Profesor titular e Investigador Principal CIC CONICET. Facultad de Ciencias Químicas Universidad Nacional de Córdoba CONICET, Córdoba, Argentina. Departamento de Química Biológica Ranwel Caputto, CIQUIBIC. Laboratorio de investigación en Cronobiología y Neurociencias de Córdoba.

Información de la línea de investigación: https://ciquibic.org.ar/guido-mario/

Resumen
Los relojes biológicos presentes en las células de todo el cuerpo y aún en líneas celulares inmortalizadas, regulan temporalmente diversos procesos fisiológicos y moleculares. La disrupción de los ritmos diarios a consecuencia de la vida moderna (turnos rotativos, jetlag, iluminación artificial, etc.) puede provocar desórdenes metabólicos y mayor riesgo de cáncer. El proceso de carcinogénesis implica la desregulación de la proliferación celular, incluyendo la reprogramación del metabolismo energético y la evasión del sistema inmune; sin embargo, poco se desconoce sobre el impacto del sistema circadiano sobre la progresión y tratamiento del cáncer. Recientemente demostramos mediante estudios ex vivo e in vivo que células tumorales gliales (T98G de glioblastoma multiforme humano, gliomas A530) contienen un reloj funcional con respuestas temporales diferenciales a la quimioterapia, al igual que cuando gliomas o melanomas (B16) fueron inoculados en ratones C57BL/6 de día o noche, observamos una mayor tasa de crecimiento tumoral cuando los inóculos fueron realizados al comienzo de la noche, mientras que la quimioterapia con Bortezomib (Bor, inhibidor de proteosoma) fue más efectiva cuando se administró a la noche (Wagner et al., 2018, 2021a). Estos resultados indican que aún en las células tumorales opera un reloj intrínseco que ejerce un preciso control temporal en el crecimiento tumoral y eficacia terapéutica, y que depende también del estado y susceptibilidad del huésped. Al presente, este laboratorio está abocado a identificar componentes claves del reloj biológico y/o blancos metabólicos objetos de la reprogramación metabólica, e implicados en el desarrollo tumoral, a fin de abordar nuevas estrategias cronofarmacológicas.

Resultados discutidos
Estudios ex vivo
- Se utilizó la línea celular T98G proveniente de glioblastoma multiforme humano. Las células se sincronizaron con pulsos de dexametazona (DEX, 100 nM) y se arrestó parcialmente su proliferación o no mediante la disminución o no del suero en el medio de cultivo.
- Se analizaron las oscilaciones metabólicas mediante la medición de la relación Fosfatidilcolina (PC)/Fosfatidiletanolamina (PE), observándose diferencias significativas en el ciclo circadiano en condición de arresto o de proliferación, con picos más anchos y de mayor amplitud en el caso de las células proliferantes. Además, se midió la expresión de genes relacionados con la síntesis de PC (ChoK) y PE (Pcyt2) en ambas condiciones observándose claras diferencias en el ritmo circadiano, volviéndose más aberrante en las células proliferantes.
- Se midieron las oscilaciones circadianas de las especies reactivas del oxígeno (EROs) observándose claras diferencias entre las células en arresto y las proliferantes, oscilando estas últimas entre niveles mayores.
- La disrupción de la expresión de Bmal1 mediante CRISPR/cas9 condujo a una disminución significativa en los niveles de la proteína Per1 (reloj biológico), codificada por uno de sus genes blanco. Para el caso de estas células en condición proliferante, se observó una marcada desregulación del ciclo circadiano para las EROs, oscilando los valores en un rango menor entre niveles altos.
- El ritmo transcripcional para Bmal1, Per1, Rev-erb, ChoK y Pcyt-2 disminuyó significativamente en el caso de las células proliferantes en comparación con las células arrestadas. En contraposición, se mantuvo el ritmo metabólico para distintos marcadores como GPLs totales, PC, PE, PC/PE, entre otros.
- Se trató a las células T98G en condiciones proliferativas con el fármaco Bortezomib a distintos tiempos luego de la sincronización con DEX y se encontró un efecto temporal significativo del tratamiento farmacológico, con los niveles más bajos de viabilidad en una ventana de tiempo que osciló entre 12 y 24 h, en la cual se encontraron altos niveles de EROs (muerte asociada a apoptosis) y un bajo metabolismo de GPLs.
- Para determinar si el reloj molecular tenía algún efecto sobre las respuestas diferenciales al tratamiento con bortezomib, se evaluó la viabilidad celular en células T98G en proliferación después de la transfección con el plásmido PX459-Bmal1 (T98G E1). En este caso la respuesta temporal al tratamiento se vio fuertemente afectada, notándose un avance en la fase de EROs con niveles más bajos de viabilidad celular entre las 6 y 12 h posteriores a la sincronización.
- Posteriormente incluyeron otro fármaco: SR9009, agonista de los receptores nucleares del ácido retinoico. Se encontró una mayor respuesta en cuanto a la disminución de la viabilidad en una ventana de tiempo entre las 12-24 hs post sincronización, pero la muerte estuvo más asociada a la autofagia que a la apoptosis.
- Al combinarse ambos fármacos en el dentro de la ventana de tiempo de máximo efecto se observó un efecto aditivo muy importante tanto a concentraciones bajas (BOR 50 mM; SR9009 10 uM) como a concentraciones altas (BOR 500 mM; SR9009 20 uM)

Estudios in vivo
- Se inocularon de manera subcutánea células A530 (derivadas de glioma murino) en ratones C57BL/6, generándose en éstos tumores en el nervio ciático. Para ello, se sincronizaron los cultivos celulares y se inoculó a los animales por la mañana o por la noche. Se sometió a los animales a 2 condiciones: ciclo de luz/oscuridad, oscuridad/oscuridad. Se monitoreó el crecimiento tumoral post inyección.
- La tasa de crecimiento tumoral resultó ser mayor para el grupo inoculado por la noche, siendo menor el tiempo de duplicación en ambos casos.
- Se observaron resultados similares al probar con otro tipo de células tumorales derivadas de melanoma: B16.
- Al inocular de día células A530 Bmal1 KD (con el reloj molecular dañado) la tasa de crecimiento fue significativamente mayor y el tiempo de replicación fue significativamente menor, en comparación con la inoculación de células A530 WT, similar a lo que ocurría con la inoculación durante la noche.
- Se inoculó a los animales con las células A530, se dejaron crecer los tumores entre 18-20 días y se inició un esquema de tratamiento (dia 1, día 3, día 5 y día 8) con BOR o vehículo (DMSO) administrado de día o de noche, a dosis baja (0,5 mg/kg) o a dosis alta (1,5 mg/kg). El tratamiento administrado de noche produjo una disminución de volumen tumoral similar a dosis altas como a dosis bajas. Sin embargo a dosis bajas no se tuvieron efectos secundarios como la pérdida de peso. Al administrar el tratamiento de día a dosis bajas no se tuvo efecto y si lo tuvo a dosis altas de forma comparable al tratamiento nocturno.
- Como conclusión, se vio una implicancia del reloj circadiano en la respuesta al tratamiento con BOR y que existe una mejor respuesta al tratamiento nocturno con menor dosis (30%) y sin efecto de pérdida de peso.

Relevancia Patológica
El glioblastoma multiforme (GBM) es el tipo de tumor cerebral más común y agresivo, clasificado como grado IV, afectando a adultos (~64 años) y con una incidencia de 3,2 casos/100.000 habitantes. Representa el 45,2% de todos los tumores malignos del SNC y 80% de todos los tumores malignos primarios del SNC. Son resistentes a las terapias convencionales con mal pronóstico tras el diagnóstico incluso cuando se aplica el protocolo Stupp que combina cirugía y radioquimioterapia, teniendo un pronóstico de 13 meses de vida. La vida moderna (trabajo por turnos, desfase horario, etc.) puede causar una desorganización circadiana que promueve un mayor riesgo de cáncer y trastornos metabólicos. Aunque se sabe poco sobre la función del reloj circadiano intrínseco del tumor, la modulación farmacológica de los componentes circadianos puede ofrecer estrategias anticancerosas selectivas. Los REV-ERB son componentes del reloj circadiano que se unen al hemo y actúan como represores de los procesos implicados en la tumorigénesis, como el metabolismo, la proliferación y la inflamación. Un derivado de pirrol sintético (SR9009) que actúa como agonista específico de REV-ERB exhibió una potente actividad in vivo sobre el metabolismo y la viabilidad de las células tumorales y se comparó con el tratamiento con el inhibidor de proteasoma Bortezomib ex vivo en células derivadas de glioblastoma multiforme humano T98G, encontrándose un efecto aditivo de ambos fármacos en la ventana temporal en la que mostraban mayor eficacia. In vivo se identificó que el tratamiento con Bortezomib resultaba más efectivo si se realizaba de noche, que si se lo administraba de día en animales nocturnos, pudiendo disminuir en ese caso las dosis, evitando de esta manera efectos adversos indeseables.

Papers relevantes
- Wagner PM, Prucca CG, Velazquez FN, Sosa Alderete LG, Caputto BL, Guido ME. Temporal regulation of tumor growth in nocturnal mammals: In vivo studies and chemotherapeutical potential. FASEB J. 2021 Feb;35(2):e21231. doi: 10.1096/fj.202001753R. PMID: 33428275.
- Wagner PM, Monjes NM, Guido ME. Chemotherapeutic Effect of SR9009, a REV-ERB Agonist, on the Human Glioblastoma T98G Cells. ASN Neuro. 2019 Jan-Dec;11:1759091419892713. doi: 10.1177/1759091419892713. PMID: 31825658; PMCID: PMC6909277.
- Wagner PM, Sosa Alderete LG, Gorné LD, Gaveglio V, Salvador G, Pasquaré S, Guido ME. Proliferative Glioblastoma Cancer Cells Exhibit Persisting Temporal Control of Metabolism and Display Differential Temporal Drug Susceptibility in Chemotherapy. Mol Neurobiol. 2019 Feb;56(2):1276-1292. doi: 10.1007/s12035-018-1152-3. Epub 2018 Jun 7. PMID: 29881948.