04 de mayo de 2023

LOS ARNs PEQUEÑOS COMO MEDIADORES DE LA COMUNICACIÓN INTERCELULAR Y LOS PECADOS DEL PADRE

Dr. Pablo Hernán Strobl-Mazzulla, Investigador Independiente (CONICET), Profesor Adjunto (UNSAM). Laboratorio de Biología del Desarrollo, Instituto Tecnológico de Chascomús (CONICET-UNSAM). https://intech.conicet.gov.ar/investigacion/laboratorio-de-biologia-del-desarrollo/

Resumen del seminario
La charla se centrará en 2 líneas de investigación utilizando 2 modelos biológicos distintos, los embriones de pollo y de peces. La primera, demostrando el rol de los ARNs pequeños cargados selectivamente en vesículas extracelulares pequeñas, los cuales son requeridos para la comunicación intercelular en el desarrollo embrionario temprano. La segunda, enfocada a cómo los ARNs pequeños presentes en el esperma actúan como mediadores de la deficiencia de folato paterna capaces de afectar el desarrollo de la descendencia.

Resultados discutidos

Proyecto N°1: Extracellular vesicle-localized miRNA-203 mediates neural crest-placode communication required for trigeminal ganglia formation (inédito)

Modelo: huevos de pollo
Llevado a cabo por: Yanel Bernardi

El ganglio trigémino es el ganglio craneal más grande que tenemos todos lo vertebrados y está relacionado con todas las percepciones de dolor, tacto, temperatura de muchas de las estructuras de la cara. Este se forma a partir de las células de la cresta neural, que a su vez provienen del ectodermo. A partir del ectodermo indiferenciado, comienzan a definirse dos territorios:
• el ectodermo no neural, que va a dar lugar a todo lo que es piel.
• y el ectodermo neural, que va a dar lugar al tubo neural, el SNC y la médula espinal.
Entre estos dos territorios es donde se va a inducir la formación del borde de la placa neural. A medida que la neurulación avanza, el pliegue neural comienza a elevarse y las células del borde neural se empiezan a especificar, expresando marcadores que las definen como tales. Al final de la neurulación el tubo neural se cierra y las células de la creta comienzan un proceso de transición epitelio-mesénquima (EMT), migrando a lo largo de embrión. Se trata de células multipotentes que van a diferenciarse en diferentes células que van a formar parte de distintos tejidos:
• ganglios craneales,
• odontoblastos,
• la mayoría de los huesos y cartílagos que forman parte de las distintas estructuras de la cara,
• tejido conectivo,
• células simpato-adrenales
• neuronas sensoriales y glia,
• células pigmentales.

El proyecto se inició con el fin de dilucidar cuáles eran los mecanismos, principalmente miRNA, que pudieran estar relacionados con la EMT-MET en el proceso de condensación del ganglio trigémino.
Con el objeto de llevar a cabo este proyecto, iniciaron haciendo aislamientos de células puras pre-migratorias, migratorias y condensantes mediante la utilización de un enhancer que se expresa exclusivamente en células de la cresta neural, valiéndose de la técnica de sorting de las células GFP+. Luego realizaron secuenciaciones masivas de mRNA-seq, ATAC-seq (para ver la estructura de la cromatina) y miRNA-seq (para ver que miRNA eran más abundantes en este proceso).
Con toda esta información, la idea fue tratar de encontrar cual era el core de miRNAs que podían regular factores de transcripción (FT) y afectar de alguna forma el estado epigenético de estas células.
Se sabía por bibliografía, que las células de la cresta neural se mantienen en el estado epitelial gracias a la presencia de la cadherina 6b (Cad6b), la cual es regulada negativamente por el FT Snail. Un miRNA llamado miR-203 mantiene reprimido a Snail y la falta de éste hace que Cad6b se mantenga expresada. En el momento en que las células comienzan la EMT, miR-203 disminuye su expresión y esto genera que aumente Snail, se reprima la expresión de Cad6b y se pierda la conectividad célula-célula posibilitando la migración. Además, se había visto que esto estaba regulado principalmente por metilaciones del ADN. Este miRNA se metilaba en su ADN y se reprimía su expresión. Una vez que las células comenzaban el proceso de migración eran rápidamente demetiladas. En base a esto, se preguntaron si la reactivación de miR-203 podía tener algo que ver con la vuelta a formar un epitelio (MET).
Para responder a esta pregunta, realizaron hibridizaciones in situ en diferentes estadios de condensación. Se vio que en el estadio de coalescencia (cuando las células comienzan a unirse) ciertas células comenzaban a reactivar la expresión de miR-203 y en el estadio de condensación había una gran abundancia de ese miRNA en el core del ganglio trigémino.
Luego procedieron a la realización de estudios de ganancia de función, postulando que la sobreexpresión de miR-203 debería forzar la condensación de las células de la cresta neural. Para llevarlo a cabo utilizaron como modelo huevos de pollo. Estos se meten en incubadoras a 38°C para posibilitar el desarrollo embrionario y al cabo de un tiempo establecido se procede a realizar una pequeña ventana en el mismo para poder acceder al embrión. Con el fin de poder visualizarlo mejor, se lo tiñe con tinta china. Luego, se inyecta el plásmido en el tubo neural que se está cerrando y se ubican dos electrodos a los costados del embrión y se realiza la electroporación. Debido a la carga negativa del ADN, éste va a migrar hacia el polo positivo, dando lugar a que solo se afecte una parte del mismo. La mitad derecha del embrión va a estar afectada con lo que queremos y la mitad izquierda sirve como control. Finalmente, se sellan los huevos con cinta scotch.
Cuando sobreexpresaron mediante la utilización de un vector plasmídico miR-203 se observaron en el lado electroporado cúmulos ectópicos de células que no se vieron en los embriones electroporados con el vector control ni en la mitad izquierda del mismo embrión (lado no electroporado). Además, se observó un ganglio trigémino más denso.
De manera similar al ensayo anterior, realizaron un experimento de pérdida de función utilizando un vector esponja para miR-203, pero para su sorpresa, no vieron ningún efecto.
Al estudiar mejor el proceso de formación del ganglio trigémino, se pueden distinguir dos tipos de células: células de la cresta neural y células de la placoda (que provienen del ectodermo no neural). Estas últimas van a migrar en sentido opuesto y se van a encontrar con las células de la cresta neural y van a formar una especie de corredor rodeado por las células de la cresta. Finalmente se produce la condensación para dar lugar a la formación del ganglio trigémino.
Teniendo en cuenta lo anterior se preguntaron: ¿Cómo el miR-203 que se produce en la cresta neural podría llegar a las células de la placoda?
En primer lugar, para comenzar a responder a esta pregunta, electroporaron con el vector esponja el territorio del embrión en donde surgen las células de la placoda para ver si miR-203 era requerido para la condensación de esas células. Los ganglios del lado tratado resultaron ser menos densos.
En estudios previos se vio que muchos miRNA son cargados dentro de vesículas intracelulares que luego se liberan al espacio extracelular como exosomas que son captados por otras células. Se pensó que esto podría estar ocurriendo entre las células de la cresta neural y las células de la placoda. Para comprobarlo, se disectaron ganglios trigéminos de embriones de pollo en el momento de la condensación y se enviaron a estudiar por microscopía electrónica. Se pudo observar el proceso de condensación y al hacer zoom en algunas de estas regiones se pudieron visualizar cuerpos multivesiculares (MVB) que tenían muchas vesículas intraluminales. Estos MVB se abrían al espacio extracelular liberando los exosomas.
Para saber si estos exosomas podían llegar a las células de la placoda se utilizó el vector pHluorin. Este codifica la proteína CD63, la cual se encuentra tanto en la membrana de los MVB como de los exosomas. Además, por un lado está fusionada a la proteína Scarlet (que da una fluorescencia roja) y por el otro lado tiene una proteína GFP poseedora de una mutación que la vuelve sensible al pH. Cuando GFP está dentro de los MVB (pH ácido), no fluorece. Cuando los exosomas son liberados al espacio extracelular (pH neutro), GFP fluorece. Insertaron este plásmido en las células de la cresta neural para ver si la proteína llegaba a las células de la placoda (marcadas con Turj1) y se observó:
-que en la región en donde se empieza a condensar el ganglio se veían células de la cresta neural GFP+, indicando la liberación de vesículas. En violeta se podían observar las células de la placoda.
-que en el citoplasma de las células de la placoda habían puntos con fluorescencia verde (GFP+).
Así, se demostró que vesículas que provenían de la cresta neural podían ser internalizadas por células de la placoda.
Para observar este fenómeno con mayor resolución se procedió a realizar un experimento similar en explantes de tejido. Los explantes se pusieron en placas y se pudo observar como al poco tiempo las células comenzaron a migrar y a interactuar entre sí. Se vio como las células de la cresta iban moviéndose y liberando vesículas a lo largo de su migración y las células de la placoda iban avanzando y emitiendo prolongaciones, observándose dentro de las mismas la internalización de puntos con fluorescencia verde.
Asimismo, quisieron ver si miR-203 podía llegar a las células de la placoda y ejercer alguna acción biológica. Para esto, por un lado electroporaron el tubo neural con el plásmido de sobreexpresión del miR-203 y por el otro electroporaron células de la placoda con un sensor dual. El mismo codifica una proteína denominada RFP (roja) que se expresa de manera constitutiva y la proteína GFP unida a una secuencia complementaria a miR-203. Si el miR-203 sobreexpresado en las células de la cresta pasa a las células de la placoda, la fluorescencia de GFP debería apagarse. En las células de la cresta se observó únicamente GFP, pero en las células de la placoda se observaron algunas GFP+/RFP+ y otras GFP-/RFP+. Cuando se sobreexpresaba miR-203, disminuía la señal de GFP. Hicieron experimentos similares con explantos y vieron exactamente lo mismo. De esta forma, se demostró que miR-203 puede pasar a la placoda y ejercer alguna acción biológica.
Por último, quisieron ver si miR-203 era cargado dentro de estas vesículas en el proceso de condensación. Para esto, disectaron muchos ganglios trigéminos e hicieron ultracentrifugaciones para aislar las vesículas. Se caracterizaron las mismas por NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) y por microscopía electrónica, pero faltaba ver si miR-203 estaba cargado en ellas. Un año atrás se había publicado que ciertos miRNA tenían exomotivos que favorecían que los mismos fuesen cargados en vesículas. También caracterizaron un cell-motivo que hacía que los miRNA fuesen retenidos en la célula y no fueran cargados en vesículas. En base a esto, comprobaron que miR-203tenía el exomotivo en su secuencia. Luego, buscaron un miRNA que se expresara a niveles parecidos pero que tuviera un cell-motivo (miR-34a-5p). Cuando se analizaron los mismos por PCR a tiempo final en ganglios trigéminos se vio que miR-34a-5b se expresaba pero sin embargo no era posible detectarlo en vesículas extracelulares. En cambio, vieron que miR-203 estaba presente tanto en ganglios trigéminos como en vesículas extracelulares aisladas.

Proyecto N°2: Paternal methotrexate exposure affects sperm small RNA content and causes craniofacial defects in the off spring

Modelo: oryzias latipes (medaka)
Llevado a cabo por: Nagif Alata Jimenez

Siempre se prestó atención a las deficiencias de ácido fólico en la mujer embarazada pero, ¿qué rol tiene la deficiencia de ácido fólico en el padre para el desarrollo de la descendencia? Esta es la pregunta que se hicieron.

El folato ingresa a la célula de dos formas:
• Receptor de folato
• Transportador de folato
Una vez que entra ingresa en un ciclo que lleva a la producción de S-Adenosilmetionina (SAM), molécula dadora de grupos metilo para todas las metiltransferasas que metilan ADN, ARN y proteínas.

Existen ciertas drogas antifolatos como el Methotrexato (MTX) que inhiben a la primer enzima del ciclo, la dihidrofolatoreductasa (DHFR). Esta es una droga que se utiliza como tratamiento para distintas enfermedades autoinmunes como artritis reumatoidea y psoriasis, también como terapia para algunos tipos de cáncer y es un potente abortivo. Está completamente contraindicado en mujeres embarazadas o que estén planificando quedar embarazadas, pero nunca se estudió que sucedía en el sexo masculino.

Plantearon como hipótesis que la exposición al MTX conduciría a un desarrollo anormal de la descendencia en peces medaka machos adultos. Para ponerla a prueba, probaron los siguientes tratamientos:
• 10 mg/kg MTX
• 50 mg/kg MTX
• Control: PBS/DMSO 1%
Se procedió a la recolección del esperma 7 días post inyección y se fecundaron oocitos de hembras wild type (WT). Al cabo de 5 días observaron que sucedía con las estructuras cráneo-faciales de la descendencia. Para esto, midieron el largo del cartílago ceratohyal y observaron que ambas dosis de MTX generaban una disminución en el largo del mismo. Además, observaron el cambio en la forma del cartílago basihyal (que se ubica en la base de la mandíbula y la sostiene. La forma normal se asemeja a una espátula, pero con el tratamiento aparecían dos fenotipos:
• Moderado: el cartílago se curvaba y adoptaba una forma similar a una cuchara
• Extremo: el cartílago adoptaba una forma de gancho
Se pudo observar que estos efectos eran más pronunciados conforme aumentaba la dosis de MTX.
Con todo esto, concluyeron que la administración me MTX en machos puede ocasionar defectos en la descendencia.
Posteriormente se preguntaron por el mecanismo involucrado y lo primero que pensaron fue en la epigenética. Las 2 principales modificaciones son la metilación en la posición 5 de la citosina y cambios en las histonas. El esperma y el desarrollo embrionario tienen sus particularidades:
• La mayoría de las metilaciones son reseteadas tanto en la espermatogénesis como en el desarrollo temprano.
• En el esperma las histonas son reemplazadas por otras proteínas, las protaminas, que permiten compactar muchísimo el ADN y que prácticamente no haya transcripción activa en el espermatozoide.
En los últimos años, surgió una corriente que postula que los ARNs pequeños son muy abundantes en el esperma. Basándose en esto, hicieron secuenciaciones masivas de ARNs pequeños y observaron que los biotipos más abundantes eran los tRNA y los miRNA. Sin embargo, cuando se trataba a los machos con MTX el pool de tRNA se convertía en el más abundante. Cuando fueron a ver los reads que mapeaban en estos tRNA, observaron que en el caso control los reads mapeaban tanto en la región 5´como en 3´. Sin embargo, al administrar MTX vieron que gran parte de los reads mapeaban solo en la región 5´.
Para explicar esto es necesario tener en cuenta como es la biogénesis de los tRNA. Éstos se forman a partir de un precursor, que al clivarse da lugar a un tRNA maduro, el cual es susceptible a su vez de ser clivado por distintas RNAasas (como Dicer, ANG) para formar mitades 3´y 5´ llamadas 3´tRNA y 5´tRNA, respectivamente. El clivaje de los tRNA depende de modificaciones en los tRNA maduros, principalmente en 5-metilcitocina, las cuales son más abundantes en las regiones 3´de estos tRNA. Esto favorece que ANG (angiogenina) los clive y que las regiones 5´sean mucho más estable que las 3´. Cuando fueron a ver si en sus tRNA tenían esas modificaciones, observaron que las fracciones de entre 20-50 nt (mitades de tRNAs) no tenían diferencias significativas entre los machos control y los tratados con MTX. Sin embargo, cuando miraron las fracciones de entre 50-90 nt (tRNAs enteros) notaron que las 5-metilcitocinas eran muchísimo más abundantes en el caso de los machos tratados con MTX.
Siendo que al haber una deficiencia de folato dada por el tratamiento con MTX uno esperaría tener una menor abundancia de metilaciones, quisieron ver si lo anterior estaba relacionado con una up-regulación de las metil transferasas involucradas en los testículos de estos peces y observaron que efectivamente estaban significativamente aumentadas para el caso del tratamiento con MTX.
Por último, hacía falta demostrar que estos tRNA eran los responsables de estas modificaciones cráneo-faciales en la descendencia. Para esto, se purificaron tRNA a partir del esperma de peces wild type (fracciones de entre 20-50 nt y entre 50-90 nt) y se fecundaron oocitos wild type. Cuando se inyectó la fracción de 50-90 nt no se observaron defectos cráneo-faciales en la descendencia a ninguna de las dosis probadas. Sin embargo, cuando se inyectó la fracción de 20-50 nt (tsRNA) se observó un aumento significativo en la incidencia de deformaciones del cartílago Basihyal. Cabe aclarar que solo se logró reproducir de esta forma el fenotipo moderado.
Con todo esto, se concluyó que el esperma tiene una especie de QR representado por la abundancia de tRNAs y que el tratamiento con MTX cambia la abundancia relativa de los mismos. Siguiendo con la analogía, el huevo sería una especie de lector QR de toda la impronta de RNAs que trae el esperma y eso daría lugar al fenotipo de la descendencia.

Relevancia Patológica

Proyecto N°1:
Defectos en cualquiera de las etapas del desarrollo mencionadas llevan a trastornos conocidos como Neurocristopatías:
• Defectos en la formación de estas células, como por ej. el Síndrome de Treacher Collins: se producen defectos en la formación de huesos y cartílagos de la cara.
• Defectos en la migración de las células, como por ej. el Síndrome de Waardenburg: los melanocitos son principalmente afectados. Se observan defectos en la pigmentación del pelo, los ojos, etc. También está relacionado con problemas auditivos.
• Defectos en la diferenciación de estas células, como por ejemplo la Craniosynostosis: se produce una diferenciación prematura de osteoblastos del cráneo, lo cual impide que el cerebro pueda crecer normalmente, haciendo que las cabezas de los bebés se deformen.
Uno de los eventos que más les interesa en el laboratorio es la transición epitelio-mesénquima (EMT-MET), lo cual hace que las células salgan del tubo neural y se vuelvan migratorias. Muchos de los miRNA, moléculas señalizadoras, factores de transcripción, moléculas de adhesión, proteasa, ligandos, receptores, etc, son muy compartidos entre las células de la cresta neural y una célula metastásica tumoral. Al igual que una célula tumoral metastásica que debe colonizar un tejido secundario, estas células tienen que volver a iniciar un proceso de transición mesenquimal-epitelial (MET) para formar órganos nuevamente. En el caso del cáncer, esto no ha sido estudiado bien por varias razones:
1. La impredecibilidad de saber cuál va a ser el tejido que esa célula metastásica va a colonizar.
2. Temporalidad: no se sabe en qué momento esa célula va a invadir dicho tejido.
3. Baja cantidad de células que finalmente van a invadir ese tejido para colonizarlo y formar el tumor secundario.
Todas estas cuestiones limitaron los estudios de MET in vivo. El aporte de la biología del desarrollo en ese aspecto puede ser muy importante ya que se conoce exactamente cuando esas células van a comenzar a migrar, en qué momento van a condensarse y además son muchas, las cuales van a dar lugar a la formación del ganglio trigémino.

Proyecto N°2:
Las anomalías congénitas involucran defectos morfológicos, funcionales y/o moleculares que ocurren desde la concepción al nacimiento.
Se sabe que las mujeres necesitan tomar suplementos de ácido fólico durante el período periconcepcional para prevenir ciertos defectos en el embrión. El folato (vitamina B9) es una vitamina esencial para los animales ya que no pueden sintetizarla, razón por la cual necesitan consumirla a través de la dieta. Éste es abundante en verduras de hojas verdes y en ciertos cítricos y legumbres.
10 a 20 de cada 10.000 nacimientos tienen defectos congénitos asociados a la deficiencia de folato. Las estadísticas cambian enormemente dependiendo del país (subdesarrollado/desarrollado) y el tipo de dieta.
Los principales defectos son:
• Defectos del tubo neural: espina bífida, anencefalia, encefalocele.
• Defectos en la cresta neural: Fisura del paladar, labio leporino.
Siempre se prestó atención a las deficiencias de ácido fólico en la mujer embarazada, pero nunca se atendió al papel que puede llegar a cumplir la deficiencia de ácido fólico en el padre para el desarrollo de la descendencia.

Papers relevantes

-Alata Jimenez N, Castellano M, Santillan EM, Boulias K, Boan A, Arias Padilla LF, Fernandino JI, Greer EL, Tosar JP, Cochella L, Strobl-Mazzulla PH. Paternal methotrexate exposure affects sperm small RNA content and causes craniofacial defects in the offspring. Nat Commun. 2023 Mar 23;14(1):1617. doi: 10.1038/s41467-023-37427-7. PMID: 36959185; PMCID: PMC10036556.