29 de junio de 2023

CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA ADENILIL CICLASA DE GIARDIA LAMBIA. Modelado molecular para el diseño, síntesis y evaluación de inhibidores específicos.

Dr. Adolfo R. Zurita, Instituto Multidisciplinario de Investigaciones Biológicas (IMIBIO-SL); área Biología Molecular, Facultad de Química, Biología y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis. https://imibio.conicet.gov.ar/wp-content/uploads/sites/47/2018/08/Proyecto-Dr.-Adolfo-Zurita.pdf

Resumen del seminario
La Giardiasis, es la infección intestinal causada por el parásito unicelular Giardia lamblia (G. lamblia) también llamado G. intestinalis o G. duodenalis, constituye una parasitosis de gran importancia epidemiológica y clínica por su alta prevalencia y patogenicidad. Es la causa más frecuente de diarrea y mala absorción en el mundo, afectando aproximadamente de 200 a 300 millones de personas cada año, fundamentalmente a la población infantil o a viajeros que visitan zonas endémicas. Durante su ciclo vital, G. lamblia presenta dos estados morfológicos característicos: El trofozoíto (forma replicativa responsable de los síntomas de giardiasis), el cual tiene una forma característica de lágrima con un tamaño de entre 12 a 15 μm de diámetro, dos núcleos idénticos, cuatro pares de flagelos y un disco adhesivo ventral que le permite adherirse a la mucosa intestinal del huésped; y el quiste (forma infectiva), que tiene un diámetro de entre 7 a 10 μm y está cubierto por una pared de naturaleza proteica y glucosídica que le confiere una gran resistencia a condiciones ambientales adversas. El pasaje del estado de quiste a trofozoíto (o viceversa), es de importancia vital para el parásito y comprende lo que se llama mecanismo de diferenciación adaptativa. Durante los últimos años, numerosas observaciones sugieren que el mensajero químico AMPc estaría involucrado en la regulación de los procesos de crecimiento y diferenciación adaptativa de G. lamblia. En este contexto, nuestro grupo de trabajo, describió que efectivamente G. lamblia expresa dos enzimas nucleotidil ciclasas de clase III (gNC1 y gNC2) y una enzima fosfodiesterasa (gPDE), las cuales estarían involucradas en la síntesis y desgraciado de AMPc en este parásito. A pesar de que la enzimas gNC1, gNC2 y gPDE pertenecen a dos familias de enzimas ampliamente distribuidas tanto en procariotas como en eucariotas, las mismas solo tienen un 30% de identidad de secuencia con respecto a enzimas presentes en sus huéspedes (ej. mamíferos). Estas diferencias, podrían emplearse como estrategia para el desarrollo de agentes farmacológicos específicos que bloqueen la fisiología normal del parásito sin afectar a su huésped. Por ende, un objetivo específico del proyecto, es la obtención de inhibidores farmacológicos para las enzimas gNC1 y gNC2 y gPDE de G. lamblia, con la esperanza de que los mismos puedan servir para el desarrollo de nuevas terapias farmacológicas.

Resultados discutidos
Lo primero que pudieron observar mediante una búsqueda bibliográfica fue que este parásito expresaba la enzima PKA, la cual se sabe que es activada por AMPc, un segundo mensajero celular. Este AMPc se genera a través de una enzima denominada adenilil ciclasa, la cual utiliza al ATP como sustrato. A su vez, los niveles de este segundo mensajero son controlados por otra enzima llamada fosfodiesterasa, que lo degrada a AMP. Teniendo en cuenta esta información, quisieron ver si este microorganismo efectivamente sintetizaba AMPc y observaron que esto era así y que además los niveles del mismo aumentaban a la hora de enquistarse disminuyendo luego lentamente.

En un ensayo posterior, analizaron el crecimiento del trofozoito utilizando un análogo no hidrolizable  (dibutiril AMPc) en vistas de que cuando se incuban en presencia de este compuesto, la fosfodiesterasa no lo puede degradar, generando un aumento de los niveles de AMPc. Esta intervención provocó un aumento de la taza de crecimiento de los trofozoitos, con lo que llegaron a la conclusión de que Giardia lamblia genera AMPc y de que de alguna forma éste está involucrado en el proceso de crecimiento y diferenciación del parásito.

En una posterior búsqueda bibliográfica, encontraron que este microorganismo poseía los genes para sintetizar 2 adenilil ciclasas y  1 fosfodiesterasa:

• La Nucleotidil ciclasa 1 (gNC1) es una proteína de 74 KDa con un solo dominio catalítico y dos dominios transmembrana. Esta forma homodímeros para ser activa.
• La Nucleotidil ciclasa 2 (gNC2) es una adenilil ciclasa muy parecida a las de mamífero. Posee dos dominios catalíticos y su actividad estaría dada por la interacción entre estos dos dominios.

Compararon la adenilil ciclasa de Giardia con la de otras especies. La gNC1 forma 2 sitios activos al conformar los homodímeros; sin embargo, gNC2 forma 1 solo sitio activo, habiéndose perdido el otro por mutaciones evolutivas, y siendo este sitio activo el opuesto al comparar con las adenilil ciclasa de mamíferos. Este análisis arrojó como conclusión que las adenilil ciclasas de Giardia Lamblia eran evolutivamente muy diferentes a las adenilil ciclasas de mamíferos.

Luego, por RT-PCR pudo comprobarse experimentalmente que los ARNm de estas enzimas estaban presentes en los trofozoitos, con lo que se procedió a obtener los amplicones correspondientes a las enzimas mencionadas (agregándoles un tag de His), aprovechando el hecho de que el ADN de estos parásitos no tiene intrones a pesar de ser eucariotas. Dichos amplicones fueron ligados a un vector de expresión (pET28) que luego se utilizó para transformar bacterias BL21 con el fin de expresar las proteínas, que posteriormente se purificaron con columnas de Ni-agarosa y fueron chequeadas tanto por western blot como por actividad enzimática. Cabe aclarar que no se pudo clonar el gen completo con el dominio transmembrana debido a la dificultad de expresar este tipo de proteínas en bacterias, con lo cual se utilizaron los productos de PCR a partir de los aminoácidos 268 y 301 para obtener construcciones más pequeñas que contenían el dominio catalítico. Se siguió trabajando con gNC1. Dado que gNC1-301 dio una mejor activdad que gNC1-268, decidieron seguir trabajando con la primera.

En posteriores estudios experimentales en los cuales se evaluó la producción de AMPc como medida de la actividad enzimática se observó que la enzima no dependía de Foscolina para activarse, que era inactiva en presencia de Mg2+ y que era activa en presencia de Ca2+ o Mn2+. La adición de Ca2+ y Mg2+ juntos no generaba ningún efecto a la acción del Ca2+ y lo mismo al poner Mn2+ y Mg2+. Sin embargo, la adición de Ca2+ y Mn2+ juntos generaba un incremento en la actividad de gNC1-301 (de todas formas, el metal fisiológico sería el Ca2+).

Se sabe que el Ca2+ generalmente inhibe a las adenilil ciclasas de mamíferos con excepción de la AC10, la cual responde a la presencia de Ca2+. La AC de Giardia se parece más a la AC10.

Como una dificultad, no existen cristales de casi ninguna proteína de Giardia lamblia. Sin embargo, existen servidores como Protein Fold Recognition Server (PHyRE2), en los que uno puede tomar la secuencia de la proteína de interés y compararlas con las secuencia de los dominios activos de otras proteínas. Luego busca en una base de datos de cristales e intenta plegar la proteína en base a esa información devolviendo una estructura que tiene una alta confiabilidad. En este caso, la estructura más confiable fue la de Spirulina platensis (1WC6) con un orden de confianza del 100% y en base al cristal de esta proteína, con el programa visualizador PyMOL, se hizo un alineamiento con la estructura obtenida para gNC1. Esto les permitió hacer una aproximación de cuales serían los aminoácidos involucrados en el sitio activo de la enzima y hacer un análisis de cómo estaría actuando.

Al comparar esta estructura con la AC de mamífero: T-517, que estaría participando en el reconocimiento del ATP, en mamíferos es un Asp en la posición 997 del sitio activo 2; y T-378 es una Gly en la posición 920 del sitio activo 2. Es decir, hay diferencias en aminoácidos claves que forman parte del sitio activo. Si se analiza el sitio activo, puede observarse que hay aproximadamente un 30% de identidad entre la AC de Giardia y la de mamífero. Lo interesante de esto, es ver como se pueden explotar estas diferencias para buscar inhibidores especícos.

A continuación, mediante una búsqueda bibliográfica de qué compuestos estaban usando para inhibir a la AC10 (debido a la similitud con gNC1), encontraron al 2-catechol estrógeno, para el cual además existían estructuras cristalinas. El siguiente paso fue probarlo con gNC1 y funcionó (IC50= 0,8 μM). Luego, comenzaron un screening de compuestos candidatos a inhibidores de AC y encontraron efecto en AMJ-147 y 237, utilizando el siguiente criterio: inhibición mayor al 50% a una concentración de 50 μM. Para el compuesto AMJ-147 se encontró una IC50= 9 μM (10 veces menos potente que el 2-catechol estrógeno). Al realizar un ensayo de medición de actividad de la gNC1 en presencia de inhibidor se vio que el 2-catechol estrógeno tenía un efecto de tipo no competitivo (igual Km y disminución de la Vmáx) y que por el contrario, AMJ-147 tenía un efecto competitivo (igual Vmáx con aumento de la Km).

Posteriormente, se refinó el modelo estructural en colaboración con otros investigadores y se realizó el modelado molecular. El análisis de docking reveló que habían 4 conformaciones que tenían un buen anclaje en el sitio activo de gNC1, lo cual sería otro indicio de que el inhibidor efectivamente se podría estar uniendo al sitio activo. La conformación que adoptaba el inhibidor ocupaba el sitio de unión al ATP, lo cual coincide con lo observado experimentalmente de que la inhibición sería competitiva. En el caso del 2-catechol estrógeno el inhibidor no desplazaba al ATP, sino que en presencia del mismo se producía un desplazamiento del Mn2+.

Con respecto a la continuidad del proyecto quedaría:

• Seleccionar/diseñar nuevos inhibidores para la gNC1.
• Ver el efecto de los inhibidores sobre trofozoitos incuvados in vitro.
• Evaluar la selectividad de los inhibidores.

Relevancia Patológica
La giardiasis es una patología causada por el parásito Giardia lamblia, un protozoo binucleado que se adhiere al intestino delgado de los seres humanos y otros animales superiores por medio de una estructura denominada disco ventral. Ésta es la causa más frecuente de diarrea y malabsorción en el mundo, afectando entre el 2-5% de personas en los países industrializados y entre el 20 y el 30% en los países en desarrollo. En Asia, Africa y América Latina, alrededor de 200 millones de personas tienen giardiasis sintomática, con cerca de 500.000 nuevos casos reportados cada año. La falta de acceso al agua potable coincide con el aumento de la incidencia

La infección puede ocurrir de manera asintomática (infección crónica), o presentar un cuadro agudo que incluye: diarrea con duración de más de 10 días, dolores abdominales, flatulencias, distensión abdominal, vómitos y pérdida de peso. La giardiasis crónica está relacionada con la disminución de la capacidad intelectual, ya que los niños no reciben los nutrintes adecuados durante su crecimiento.

El ciclo comienza con la ingestión de agua y/o comida contaminada con los quistes del parásito. Cuando éstos llegan al estómago, el ácido induce el proceso de desenquistamiento dando lugar al estadío de trofozoito. Los trofozoitos comienzan a proliferar en el intestino delgado tapizando todo su interior, convirtiéndose nuevamente en quistes al llegar al intestino grueso, que son expulsados con las heces.

Papers relevantes
-Saraullo V, Di Siervi N, Jerez B, Davio C, Zurita A. Synthesis and degradation of cAMP in Giardia lamblia: possible role and characterization of a nucleotidyl cyclase with a single cyclase homology domain. Biochem J. 2017 Nov 21;474(23):4001-4017. doi: 10.1042/BCJ20170590. PMID: 29054977.