17 de agosto de 2023

CULTIVOS 3D Y NUEVAS ESTRATEGIAS DE MARCACIÓN FLUORESCENTE PARA EL ESTUDIO DEL CILIO PRIMARIO. 

Dra. Lucila G. Pescio. Investigadora Asistente CONICET, IQUIFIB – UBA-CONICET y Jefa de Trabajos Prácticos, Cátedra de Biología Celular y Molecular, FFyB – UBA.

Resumen del seminario
El cilio primario es un cilio único que presenta una membrana especializada. En el riñón su presencia es marcador de diferenciación y su desarrollo defectuoso lleva a ciliopatías como la poliquistosis renal. En nuestro laboratorio demostramos que la hipertonicidad induce la ciliogénesis en células MDCK, a través de un proceso mediado por esfingolípidos, y actualmente nos encontramos estudiando los mecanismos involucrados. Estamos desarrollando nuevas estrategias de marcación fluorescente que incluyen proteínas de fusión con Halo-Tags y cultivos 3D de células MDCK. Estas células cultivadas en una matriz de colágeno forman quistes que sirven como modelos preclínicos para el estudio de fármacos para el tratamiento de la poliquistosis renal.

Resultados discutidos
• Diferencias entre cilios primarios y otros tipos de cilios. Un cilio primario es un cilio único no móvil, porque no tiene los microtúbulos en el centro (9+0), por ende, no tiene las proteínas motoras a diferencia del resto de cilios que tiene un citoesqueleto de tubulina (9+2).
• El cilio primario forma parte de la mayoría de células eukariontes, la membrana ciliar esta enriquecida especialmente con esfingolípidos y PI4P y presenta ciertos receptores específicos (ejem: GPCR).
• La enzima Glucosil-ceramida Sintasa (GCS), es la enzima limitante de la síntesis de esfingolípidos. Esta enzima fue estudiada en la diferenciación de las células MDCK, que es una línea celular derivada de túbulos colectores renales que tiene la capacidad de diferenciarse.
• A partir del efecto de hipertonicidad, las células MDCK desarrollan una membrana apical madura y una membrana basolateral que se distingue fácilmente luego de 48h de incubación. Buscando marcadores de diferenciación se encontró que el cilio primario en las células renales es un marcador de etapa final de diferenciación.
• Para estudiar la importancia de la síntesis de los esfingolípidos para la diferenciación de células MDCK se utilizó las GCS como blanco y dos estrategias: el PDMP que es un inhibidor farmacológico de la enzima y un siRNA específico para GCS.
• A las 72H el número de células tratadas bajo hipertonicidad tanto con PMDP como con GCS KD, disminuyo significativamente.
• Durante el post-doc mediante espectrometría de masa, pudieron poner a punto la caracterización de las especies moleculares de los esfingolípidos en las distintas etapas. Llegando a la conclusión que los GSLs (glicoesfingolípidos) responsables de la diferenciación proviene de un pool de ceramida específico generado por vía de reciclaje.
• Un de las interrogantes fue colocar a los esfingolípidos como parte esencial de la maquinaria para la biogénesis del cilio primario. Objetivo: Monitorear el desarrollo del cilio primario por microscopía de células vivas en células MDCK. A partir de proteínas fluorescente como la tubulina-GFP (marcador de cilio primario), Cetrin2-dsRed (marcador de centrosoma) , MKLP1-GFP (marcador de cuerpo medio).
• Las etiquetas de halo no son proteínas que fluorescen, sino que, es una proteína que se genera como proteína de fusión pero que no emiten fluorescencia hasta que se le agregué un fluorocromo exógeno. Esta combinación me permite tener una proteína de fusión que es específica para la proteína de interés con un tag fluorescente.
• Objetivo: Estudiar los mecanismos por los cuales los glicoesfingolípidos median la generación de quistes renales, haciendo hincapié en la importancia del cilio primario y para eso propusieron cultivos de células en 3D.

Relevancia Patológica
• Los glicoesfingolípidos y el cilio primario se convierten en actores principales de la formación de quistes renales.
• La poliquistosis renal se caracteriza por alteraciones en la PC1 o PC2, que son proteínas receptoras canales que forman un complejo en la membrana ciliar.
• La enfermedad renal poliquística autosómica dominante (ADPKD), es causada por mutaciones en Pkd1 (85%) o Pkd2(15%), es el trastorno renal hereditario más común y es cuarta causa de insuficiencia renal crónica en el mundo.
• Molecularmente en la ADPKD, el AMPc esta aumentado lo que lleva a la activación de vías proliferativas y contribuye a un aumento de la proliferación de células quísticas. También promueve la secreción de cloruro apical, lo que lleva a un aumento de la secreción de líquidos y por ende el volumen de los quistes.
• Tanto en riñones humanos de personas que presentan ADPKD, como en cultivos celulares y en modelos murinos de PKD se encuentra un aumento de la síntesis de esfingolípidos que es considerado un Hallmark de poliquistosis renal.
• Los cilios primarios en los pacientes con ADPKD, promueven el crecimiento de quistes cuando la función de las proteínas policistinas esta alterada.
• Cuando las células MDCK crecen en cultivos 3D imitan el transporte de líquidos de los quistes de los pacientes con ADPKD, experimentan proliferación y remodelación de la matriz y al igual que en ADPKD la mayoría de los quistes se originan a partir de las células principales de los túbulos colectores .
• En cultivos 3D a partir del día 4 se empieza a generar el lumen y en las imágenes de los esferoides se puede observar cilios alargados dentro de los quistes.

Perspectivas futuras
• ¿Cuál es la base molecular de la acumulación de GSLs y porque se acumulan en la ADPKD?
• ¿Cuáles son los mecanismos por los cuales la acumulación de GSLs media la formación de quistes?
• Determinar si los cilios alargados que se observaron dentro de los quistes en los cultivos 3D son cilios funcionales.
• Obtener células a partir de la técnica CRISPR/Cas9 para MDCK Pkd1-/-, generar los quistes y estudiar la presencia de cilio primario en esas células.
• Analizar la lipidómica de los quistes que se vayan obteniendo.
• Analizar el efecto de la inhibición de los GSLs sobre las vías de señalización de Akt-mTOR y MERK-ERK.

Papers relevantes

  • Romero, D. J., Pescio, L. G., Santacreu, B. J., Mosca, J. M., Sterin-Speziale, N. B., & Favale, N. O. (2023). Sphingosine-1-phosphate receptor 2 plays a dual role depending on the stage of cell differentiation in renal epithelial cells. Life Sciences, 316, 121404.
  • González, H. F., Malpeli, A., Fasano, V., Pescio, L. G., Sterin-Speziale, N. B., & Visentin, S. (2023). Fatty Acid Percentage Distribution in Complex Lipids of Breast Milk From Mothers on a Low Docosahexaenoic Acid Diet. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 77(1), e8-e11.
  • Casali, C. I., Pescio, L. G., Sendyk, D. E., Erjavec, L. C., Gómez, E. M., Parra, L. G., & Fernández-Tomé, M. C. (2023). Dynamics of differentiated-renal epithelial cell monolayer after calcium oxalate injury: The role of cyclooxygenase-2. Life Sciences, 319, 121544.
  • Brandán, Y. R., Favale, N. O., Pescio, L. G., Santacreu, B. J., Guaytima, E. D. V., Sterin‐Speziale, N. B., & Márquez, M. G. (2022). Influence of sphingomyelin metabolism during epithelial–mesenchymal transition associated with aging in the renal papilla. Journal of Cellular Physiology, 237(10), 3883-3899.
  • Santacreu BJ, Romero DJ, Pescio LG, Tarallo E, Sterin-Speziale NB, Favale NO. Apoptotic cell extrusion depends on single-cell synthesis of sphingosine-1-phosphate by sphingosine kinase 2. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 2021 Apr;1866(4):158888. doi: 10.1016/j.bbalip.2021.158888. Epub 2021 Jan 15. PMID: 33454434.
  • Santacreu BJ, Pescio LG, Romero DJ, Corradi GR, Sterin-Speziale N, Favale NO. Sphingosine kinase and sphingosine-1-phosphate regulate epithelial cell architecture by the modulation of de novo sphingolipid synthesis. PLoS One. 2019 Mar 21;14(3):e0213917. doi: 10.1371/journal.pone.0213917. PMID: 30897151; PMCID: PMC6428330.
  • Pescio LG, Santacreu BJ, Lopez VG, Paván CH, Romero DJ, Favale NO, Sterin-Speziale NB. Changes in ceramide metabolism are essential in Madin-Darby canine kidney cell differentiation. J Lipid Res. 2017 Jul;58(7):1428-1438. doi: 10.1194/jlr.M076349. Epub 2017 May 17. PMID: 28515139; PMCID: PMC5496039.
  • Favale NO, Pescio LG, Santacreu BJ, Márquez MG, Sterin-Speziale NB. Participation of prostaglandin D2 in the mobilization of the nuclear-localized CTP:phosphocholine cytidylyltransferase alpha in renal epithelial cells. Biochim Biophys Acta. 2016 Jun;1861(6):513-23. doi: 10.1016/j.bbalip.2016.03.025. Epub 2016 Mar 28. PMID: 27032756.
  • Favale NO, Santacreu BJ, Pescio LG, Marquez MG, Sterin-Speziale NB. Sphingomyelin metabolism is involved in the differentiation of MDCK cells induced by environmental hypertonicity. J Lipid Res. 2015 Apr;56(4):786-800. doi: 10.1194/jlr.M050781. Epub 2015 Feb 10. PMID: 25670801; PMCID: PMC4373737.